Survival of vitrifi ed mouse blastocysts loaded intoglass micro-capillaries / Sobrevivencia embrionaria de blastocistos murinos vitrificados en microcapilares de vidrio / Sobrevivência embrionária de blastocistos murinos vitrificados em micro capilares de vidro

The purpose of this study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouseblastocysts loaded into glass micro-capillaries (Brand® - 5 μL). Early morning on day 4 of pregnancy,blastocysts were collected from donors, morphologically evaluated, and then allocated in three groups:Group 1 (Control): embryos were transferred into 100 μL of KSOM medium drops and in vitro culturedduring 72 h; Groups 2 and 3: embryos initially exposed to the equilibration solution (PBSm + 10% EG+ 10% PROH and 0.5% PVA) for 1 min, and then to vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20%PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. After that, blastocysts were loaded into glass micropipettes (GMP) or glassmicrocapillaries (GMC) and plunged into super-cooled liquid nitrogen (-200 °C). Embryo warming andcryoprotectant dilution were carried out into 500 μL droplets of PBSm supplemented with 0.25 M sucrosemaintained at 37 °C. After 5 min embryos were transferred to 100 mL droplets of KSOM medium andcultured in vitro for 72 h. Blastocyst expansion rates after in vitro culture were 77% (138/177) and 74%(131/175), for blastocysts vitrified in GMP and GMC, respectively. Blastocyst hatching rate (control group)was 91% (134/146), which was higher than for embryos loaded in GMP 61% (108/177) and GMC 53%(93/175). ICM number in control group embryos contained 25.7 ± 2.5 cells and did not differ from themean cell number observed in vitrified embryos loaded in GMP (24.2±2.3) or GMC (22.5±2.59). Regardingthe trophoectoderm cell number, Group 1 embryos displayed 63.1±3.0 cells, and also not differ from the cellnumbers of the embryos loaded into GMP (58.0±1.8) or GMC (58.0±.3.7). In conclusion, manufacturedGMC (Brand®) tested in this study showed same efficiency as GMP for vitrification of mouse blastocysts.

El objetivo de este estudio fue determinar las tazas de expansión y eclosión in vitro de los blastocistosmurinos vitrificados en micro-capilares de vidrio (Brand® - 5 μL). En el día 4 de preñez, los blastocistoseran colectados de las donantes, evaluados morfológicamente y localizados en tres diferentes grupos:Grupo 1 (Control): compuesto por los embriones que eran transferidos a gotas de 100 μL de medio KSOMy cultivados in vitro por un periodo de 72 h; Grupos 2 y 3: compuesto por los embriones que eran expuestosinicialmente a la solución de equilibrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min,y posteriormente a la solución de vitrificación (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por unperiodo de 30 seg. Posteriormente, los blastocistos, eran almacenados dentro de micro-pipetas de vidrio(GMP) o micro-capilares de vidrio (GMC) y sumergidos en nitrógeno líquido (-200 °C). La dilución delos crioprotectores y desvitrificación de los embriones fue realizada al colocarlos en gotas de 500 μLde PBSm suplementado con 0.25 M de sacarosa a una temperatura de 37 °C. Después de 5 minutos losembriones fueron transferidos a gotas de 100 μL de medio KSOM y cultivados in vitro por 72 h. Las tazasde expansión de los blastocistos, posteriores al cultivo fueron de 77% (138/177) y 74% (131/175), para losblastocistos vitrificados en GMP y GMC, respectivamente. Las tazas de eclosión fueron de 91% (134/146)para el grupo control, siendo mayores que para los embriones vitrificados en GMP 61% (108/177) y GMC53% (93/175). El número del índice de masa celular interna (ICM) para los embriones del grupo controlfue de 25.7 ± 2.5 células, no teniendo diferencia significativa con el número de células observado en losembriones vitrificados en GMP (24.2±2.3) ó GMC (22.5±2.59).

O objectivo de este estudo foi determinar as taxas de expansão e eclosão in vitro dos blastocitos murinosvitrificados em micro capilares de vidro (Brand® - 5 μL). No quarto dia de prenhes, os blastocitos foramcolectados das doadoras, avaliados morfologicamente e localizados em três diferentes grupos: Grupo 1(Controle): composto por os embriões que foram transferidos a gotas de 100 μL de KSOM e cultivados invitro por um período de 72 h; Grupos 2 e 3: composto por os embriões que foram expostos inicialmente ásolução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH e 0.5% PVA) por 1 min, e posteriormente á soluçãode vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por um período de 30 seg. Posteriormente,os blastocistos, foram armazenados dentro de micro pipetas de vidro (GMP) ou micro capilares de vidro(GMC) e submergidos em nitrogénio líquido super-resfriado (-200°C). A diluição dos crioprotetores edesvitrificação dos embriões foi realizada ao colocar-lhos em gotas de 500 μL de PBSm suplementadocom 0.25 M de sacarose a uma temperatura de 37 °C. Depois de 5 minutos, os embriões foram transferidosa gotas de 100 μL de KSOM e cultivados in vitro por 72 h. As taxas de expansão dos blastocistos, posterioresao cultivo foram de 77% (138/177) e 74% (131/175), para os blastocistos vitrificados em GMP e GMC,respectivamente. As taxas de eclosão foram de 91% (134/146) para o grupo controle, e foram maioresos embriões vitrificados em GMP 61% (108/177) e GMC 53% (93/175). O número do índice de massacelular interna (ICM) para os embriões do grupo controle foi de 25.7 ± 2.5 células, não havendo diferenciasignificativa com o número de células observado em embriões vitrificados em GMP (24.2±2.3) ou GMC(22.5±2.59). Alem do mais, as células do trofoectodermo, no grupo controle apresentaram 63.1±3.0células, no sendo diferente às células dos embriões vitrificados em GMP (58.0±1.8) ou GMC (58.0±.3.7).

Effect of two temperatures on in vitro nuclear maturation of bitch oocytes: relation to time culture intervals

In the present study, two commonly incubation temperatures used on in vitro oocyte maturation in canine species (Canisfamiliaris) were analysed with the aim to verify the rate of nuclear maturation of bitch oocytes after three culture intervals (48, 72and 96 h). The culture medium was TCM 199, supplemented with 25mM Hepes/l (v/v), with 10% heat inactivated estrous cowserum (ECS), 50mg/mL gentamicin, 2.2mg/mL sodium bicarbonate and 22mg/mL pyruvic acid, 1.0mg/mL oestradiol (E 8875Sigma), 0.5mg/mL FSH (Folltropin-V, Vetrepharm Inc. Ont, Canada) and 0.03IU/mL hCG (Profasi HP, Serono, Aubonne,Switzerland). Oocytes were recovered from ovaries of bitches at random estrous cycle stages by routine ovariohysterectomy(n=14) or by therapeutical ovariohysterectomy (n=8) at the veterinary hospital of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul(UFRGS), Brazil. There was no statistical difference in the rate of meiosis of oocytes matured at 37oC or at 39oC at any time point.However, the proportion of oocytes that reached the metaphase II (MII) stage at 37o C after 72 h of in vitro culture (16/123; 13%),tended to be higher (P=0.064), when compared to that matured at the 39oC (6/148; 4,1%). The results demonstrate thattemperatures of 37oC and 39oC are equally effective for the in vitro culture of bitch oocytes.